呋喃妥因代謝物檢測試劑盒使用說明書（酶聯免疫法）

1 呋喃妥因代謝物檢測試劑盒原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜、魚、蝦、禽、肝臟等中的呋喃妥因代謝物（AHD），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的呋喃妥因代謝物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟…………………………0.1ppb
蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb
奶粉、蛋粉…………………………0.1ppb
魚/蝦等水產品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb
2.4 交叉反應率：
呋喃妥因代謝物…………………100%
呋喃唑酮代謝物…………………<0.1%
呋喃西林代謝物…………………<0.1%
呋喃他酮代謝物…………………<0.1% 
2.5 樣本回收率：
組織、肝臟…………………………85±25%
蜂蜜、牛奶、腸衣…………………80±20%
奶粉、蛋粉…………………………85±25%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液：各1ml
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
高標準液（紅蓋）：100ppb…………1ml
衍生化試劑（黑蓋）………………10ml
酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、濃HCl、K2HPO4·3H2O、亞硝基鐵化鉀（K2Fe(CN)5(NO)?2H2O）、ZnSO4·7H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液1：0.36M亞硝基鐵化鉀溶液（牛奶、奶粉樣本）
11.9g亞硝基鐵化鉀加去離子水至100ml溶解。
配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）
    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。
配液3：0.1M  K2HPO4 溶液
    稱11.4g K2HPO4?3H2O加去離子水溶解定溶至500ml。
配液4：1M  HCL 
    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL。
配液5：1M  NaOH溶液
    稱取4g NaOH，加去離子水定容至100ml。
配液6：復溶液
    將2×復溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復溶，復溶液在4℃環境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶樣本處理方法
1）取5ml樣本于離心管中，加250ul 亞硝基鐵化鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉/分離心10分鐘；
2）取上清1.1ml，加4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
3）在37℃夜孵育(約16小時)或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時；
4）分別加入5ml 0.1M K2HPO4 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振蕩5分鐘；
5）室溫下4000轉/分，離心10分鐘； 
6）取出2.5ml的上層液到另一個離心管中，50-60℃氮氣或空氣吹干；
7）用1ml正已烷溶解殘留物，加入1ml復溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉/分，離心10分鐘；
8）去除上層正已烷，取50μl下層液用于分析。
    樣本稀釋倍數為2    檢測下限：0.1ppb
5.3.2 奶粉、蛋粉樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
2）在37℃夜孵育(約16小時)或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時；
3）加250ul 亞硝基鐵化鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉/分離心10分鐘；
4）取全部上清到另一個離心管中，后續接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，4）”
5.3.3 蜂蜜、組織、腸衣、肝臟、雞蛋樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
2）后續接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”
5.3.4 熟食樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質樣于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水，振蕩2min，室溫4000轉/分，離心5分鐘，去除全部液體；
2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振蕩2min，室溫4000轉/分，離心5分鐘，去除全部液體；
3）在沉淀中加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
    注：熟食的添加回收試驗請在此步加入高標準。
4）后續接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”
6 酶聯免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。